由于細(xì)胞是生物學(xué)的基本單位，研究人員正更加努力地嘗試將它們進(jìn)行單個(gè)分離、研究和比較。DNA研究主要涉及的是測(cè)序單細(xì)胞微生物相對(duì)簡單的基因組；而更大更復(fù)雜的人類細(xì)胞基因組則是一個(gè)更大的挑戰(zhàn)。隨著測(cè)序成本的大幅度下降，破譯來自單細(xì)胞的30億堿基的基因組并逐個(gè)細(xì)胞比較序列正在變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)。
在過去的幾十年里，研究人員對(duì)于來自許多物種的成千上萬的基因進(jìn)行了測(cè)序。幾乎在所有情況下，破譯的DNA都是從數(shù)百萬的細(xì)胞中提取出來并混合在一起。其結(jié)果是大量的數(shù)據(jù)，但是博德研究所的遺傳學(xué)家Joel Hirschhorn說：“當(dāng)你看向的是整個(gè)細(xì)胞群時(shí)，有許多的現(xiàn)象其中包括大量細(xì)胞與細(xì)胞間的變異就會(huì)變得不再明顯?！边@有可能會(huì)改變。
在會(huì)上，四個(gè)小組描述了關(guān)于基因組如何生成多樣性和什么導(dǎo)致特異腫瘤耐受治療的新見解——所有的都是來自單個(gè)人類細(xì)胞DNA測(cè)序的結(jié)果。他們的報(bào)告引發(fā)了科學(xué)家對(duì)單細(xì)胞測(cè)序潛力的興奮。“我們才剛剛開始觸及表面?！盚irschhorn說。
由于細(xì)胞是生物學(xué)的基本單位，研究人員正更加努力地嘗試將它們進(jìn)行單個(gè)分離、研究和比較（Science, 7 January 2011, p.24）。DNA研究主要涉及的是測(cè)序單細(xì)胞微生物相對(duì)簡單的基因組；而更大更復(fù)雜的人類細(xì)胞基因組則是一個(gè)更大的挑戰(zhàn)。隨著測(cè)序成本的大幅度下降，破譯來自單細(xì)胞的30億堿基的基因組并逐個(gè)細(xì)胞比較序列正在變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)。
對(duì)于艾伯特·愛因斯坦醫(yī)學(xué)院的統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)家Adam Auton而言，單細(xì)胞測(cè)序提供了一個(gè)了解重組（細(xì)胞分裂過程中配對(duì)染色體交換DNA片段的過程）的窗口。重組通過將各種版本的基因一起放置在新組合中幫助生成了遺傳多樣性。它也是細(xì)胞剔除異常DNA的一種方法。
研究人員長期以來一直在尋求一種途徑來測(cè)定發(fā)生在人類重組量，他們提出了一些間接的方式在家庭中或在群體中對(duì)其進(jìn)行測(cè)量。“測(cè)序和比較單個(gè)精子細(xì)胞的基因使得直接且更為系統(tǒng)地探究了這一現(xiàn)象?！盇uton說。
通過對(duì)單個(gè)精子細(xì)胞測(cè)序，研究人員正在解析重組率
因此，當(dāng)中國強(qiáng)大的測(cè)序機(jī)構(gòu)北京基因組研究所（Beijing Genomics Insititute）告訴Auton已經(jīng)完成了對(duì)一名50歲年紀(jì)亞洲男性的167個(gè)精子的測(cè)序時(shí)，Auton熱切地想要看到數(shù)據(jù)。他初期的分析突出了分離單細(xì)胞以及可靠地拷貝DNA進(jìn)行測(cè)序是多么的困難。研究人員發(fā)現(xiàn)了若干來自多種細(xì)胞的DNA序列；然而只有40個(gè)達(dá)到了標(biāo)準(zhǔn)。通過將每個(gè)精子的DNA與來自血液樣本的DNA進(jìn)行比較，Auton和他的同事們檢測(cè)到了近1000次重組事件，每個(gè)精子細(xì)胞約24.5次，這一數(shù)字與來自間接方法的預(yù)測(cè)相一致。重組在整個(gè)染色體不均衡發(fā)生，一些“熱點(diǎn)”（hot spot）代表了重組率增高位點(diǎn)。大多數(shù)情況下，Auton發(fā)現(xiàn)的熱點(diǎn)與研究人員在其他研究中看到的相一致。然而在15號(hào)染色體上也有一個(gè)重組波峰，Auton在會(huì)議上報(bào)告說。
來自斯坦福大學(xué)的Stephen Quake一直在利用一種所謂的芯片實(shí)驗(yàn)室（lab on a chip）開發(fā)單細(xì)胞技術(shù)。樣本通過一連串微通道和微閥門分離單個(gè)細(xì)胞提取出DNA，并拷貝數(shù)千次以獲得足夠的量用于測(cè)序。Quake報(bào)告說他已經(jīng)解決了許多技術(shù)問題。他在去年已經(jīng)完成了人類的單細(xì)胞測(cè)序，現(xiàn)在他正利用這項(xiàng)技術(shù)研究精子細(xì)胞中的重組并分析突變率。
這一微流體設(shè)備分離了單個(gè)細(xì)胞并復(fù)制了它們的DNA
在單細(xì)胞研究的大潮中，新的測(cè)序方法層出不窮。不過，很少有人對(duì)這些方法進(jìn)行系統(tǒng)的比對(duì)。慕尼黑大學(xué)生物學(xué)家Wolfgang Enard團(tuán)隊(duì)，在小鼠胚胎干細(xì)胞的基因表達(dá)研究中比較了一些常用的單細(xì)胞測(cè)序方法，包括Smart-seq、CEL-seq、SCRB-seq和Drop-seq。
01-Smart-seq
SMART（Switching mechanism at 5’ end of the RNA transc ript）是一個(gè)具有里程碑意義的重要技術(shù)。實(shí)際上，能夠從單細(xì)胞生成全長cDNA的測(cè)序方案并不多，Smart-seq就是其中之一。對(duì)于等位基因特異性表達(dá)或者剪接變體研究來說，覆蓋整個(gè)轉(zhuǎn)錄組是一件非常重要的事情。
Fluidigm C1單細(xì)胞制備系統(tǒng)能夠自動(dòng)完成Smart-seq步驟。你只需要將制備好的細(xì)胞懸液加進(jìn)去，儀器就會(huì)分離并裂解細(xì)胞，把mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增后的cDNA可以拿來測(cè)序，也可以進(jìn)行qPCR檢測(cè)。
在Enard的比較研究中，F(xiàn)luidigm C1系統(tǒng)的Smart-seq比較靈敏，成本也較高。這一系統(tǒng)使用的微流體芯片不能重復(fù)使用，不過這種芯片可以放到顯微鏡下觀察，證實(shí)健康單細(xì)胞的存在。
02-CEL-seq
CEL-seq（Cell ex pression by linear amplification and sequencing）是一種采用線性擴(kuò)增的常用測(cè)序方法。線性擴(kuò)增的主要優(yōu)勢(shì)是錯(cuò)誤率比較低，不過線性擴(kuò)增和PCR都存在序列依賴性偏好。
CEL-seq技術(shù)發(fā)表于2012年，主要是分離單細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)錄帶有poly-A 尾巴的mRNA片段，給它們貼上代表其細(xì)胞來源的條碼。2014年Science雜志發(fā)布的MARS-seq與CEL-seq很類似。
CEL-seq和其他線性擴(kuò)增方法生成文庫花費(fèi)的時(shí)間要稍微長一點(diǎn)。不過，CEL-seq在早期階段就給樣本貼上條碼并進(jìn)行混合，大大減少了手動(dòng)操作的時(shí)間。PCR是在實(shí)驗(yàn)的最后階段使用的，主要是為了連接正確的測(cè)序接頭。
CEL-seq所需試劑都是現(xiàn)成的，大約兩天時(shí)間生成測(cè)序文庫和測(cè)序數(shù)據(jù)，Yanai指出。需要注意的是，CEL-seq與大多數(shù)方案一樣，測(cè)序轉(zhuǎn)錄本的3’端。Enard在實(shí)驗(yàn)研究中用到了CEL-seq數(shù)據(jù)，從這項(xiàng)研究來看，CEL-seq的重現(xiàn)性較好。
GitHub網(wǎng)站提供有CEL-seq可用的生物信息學(xué)工具。Yanai研究團(tuán)隊(duì)正在開發(fā)新版本CEL-seq2，新版本的靈敏度將比舊版本高三倍。
03-SCRB-seq
Broad研究所開發(fā)的SCRB-seq（single-cell RNA barcoding and sequencing）技術(shù)采用的是PCR擴(kuò)增。該技術(shù)需要結(jié)合流式細(xì)胞儀（FACS）或者其他細(xì)胞分選方法，把單細(xì)胞分配到微孔里去。
SCRB-seq與Smart-seq比較相似，只不過SCRB-seq會(huì)整合特異性的細(xì)胞條碼，以分辨擴(kuò)增分子的來源，更準(zhǔn)確的定量轉(zhuǎn)錄本。此外，SCRB-seq并不生成全長cDNA，而是像CEL-seq一樣富集RNA 3’端。
2014年，他們將SCRB-seq技術(shù)提前發(fā)布在BioRXiv上。隨后他們對(duì)這一技術(shù)進(jìn)行了更新，并將其更名為“high-throughput eukaryote 3’ digital gene ex pression”。Broad研究所仍提供有SCRB-seq技術(shù)服務(wù)，SCRB-seq也被整合到了Wafer GenBio systems公司的scRNA-seq平臺(tái)上。據(jù)說Fluidigm公司的C1系統(tǒng)很快也將支持SCRB-seq方案。SCRB-seq目前是Enard比較中意的測(cè)序方法，它不僅適用于單細(xì)胞RNA測(cè)序，還能支持大量細(xì)胞（bulk）的RNA測(cè)序?？上У氖荢CRB-seq并不好DIY，研究者自己很難將測(cè)序流程與FACS對(duì)接起來。
04-DROP-seq和inDROP
哈佛醫(yī)學(xué)院的研究人員開發(fā)了以微滴為基礎(chǔ)的兩種獨(dú)立技術(shù)Drop-seq和inDrop。他們利用微流體裝置將帶有條碼的微珠和細(xì)胞一起裝入微小的液滴，建立了快速、廉價(jià)、高通量的單細(xì)胞RNA-seq方法。這兩種技術(shù)將細(xì)胞隔離在微小的液滴中，裝上用于擴(kuò)增的條碼引物，由此檢測(cè)數(shù)以千計(jì)的細(xì)胞。研究者們認(rèn)為，Drop-seq和inDrop能夠幫助生物學(xué)家進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)和分類人體細(xì)胞，繪制大腦等復(fù)雜組織的細(xì)胞多樣性圖譜，更好地了解干細(xì)胞分化，獲得更多疾病的遺傳學(xué)信息。
Enard及其同事發(fā)現(xiàn)，Drop-seq在單個(gè)細(xì)胞中檢測(cè)的基因數(shù)還不到Smart-seq/C1、CEL-seq和SCRB-seq的一半。不過，在統(tǒng)計(jì)學(xué)水平上研究差異性表達(dá)的時(shí)候，高通量Drop-seq和SCRB-seq是比較劃算的。哈佛醫(yī)學(xué)院Steve McCarroll實(shí)驗(yàn)室去年下半年根據(jù)用戶反饋，在自己網(wǎng)站上公布了3.1版的Drop-seq（mccarrolllab.com/dropseq）。
參與開發(fā)SCRB-seq的Stefan Semrau正在搭建自己的Drop-seq平臺(tái)。Semrau從Whitehead生物醫(yī)學(xué)研究所搬到Leiden物理研究所的時(shí)候，發(fā)現(xiàn)自己用FACS已經(jīng)不那么方便了，于是他為新實(shí)驗(yàn)室選擇了Drop-seq。建立微流體芯片和液滴系統(tǒng)是整個(gè)過程中比較艱難的部分，不過Semrau實(shí)驗(yàn)室的一名微流體博士后僅用三周就搞定了這些問題。Drop-seq文庫制備是任何分子生物學(xué)研究者都熟悉的標(biāo)準(zhǔn)操作。據(jù)Semrau估計(jì)，搭建和優(yōu)化Drop-seq大概只需要六個(gè)月時(shí)間。
05-scMT-seq
加州大學(xué)范國平教授和同濟(jì)大學(xué)薛志剛教授在5月5日的Genome Biology雜志上發(fā)布了自己開發(fā)的新測(cè)序方法——scMT-seq。這種方法能夠同時(shí)分析單個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和甲基化組。
研究人員用這種方法對(duì)感覺神經(jīng)元進(jìn)行研究，揭示了細(xì)胞間的轉(zhuǎn)錄組和甲基化組異質(zhì)性。不過，這些差異大多不是啟動(dòng)子甲基化造成的。舉例來說，啟動(dòng)子帶CpG島的基因，表達(dá)水平與基因體甲基化正相關(guān)。這項(xiàng)研究表明，scMT-seq可以用來檢測(cè)單細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄組、甲基化組和單核苷酸多態(tài)性信息，進(jìn)而解析表觀遺傳學(xué)基因調(diào)控機(jī)制。
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